无公害食品 猪肉
D.7.1.14 给每个样品、空白和添加对照准备一根C18柱，顺序用5 mL甲醇、5 mL三氯甲烷、5 mL甲醇和10mL水洗涤C18柱。弃掉洗涤液。
D.7.1.15 用一次性巴氏吸管吸取全部水相溶液装入C18柱过柱，弃掉流出液。
D.7.1.16 用1 mL水混合淋洗样品管2遍，并将淋洗液加入C18柱过柱，弃掉流出液。
D.7.1.17 用1 mL水，然后2mL甲醇-水（2+8）洗涤C18柱。让最后一次洗涤液完全流出C18柱。弃掉洗液。
D.7.1.18 用乙腈将C18柱中的氯霉素洗脱，洗脱2次，每次1.5 mL，合并洗脱液到一干净的10mL培养管中。
D.7.1.19 在氮气流下，用温度约60℃的沙浴蒸发去除乙腈至约为0.5mL。
D.7.1.20 转移至1 mL锥形瓶中。用0.5mL乙腈洗涤10mL培养管，旋涡混合5s，并将洗涤液加到1 mL锥形瓶中。在60℃用氮气流吹干。
注意：从这儿开始要防潮。
D.7.1.21 向干的残留物中加200μL Sylon HTP。
D.7.1.22 盖塞并旋涡混合5 s。在60℃～70℃沙浴中反应15 min。
D.7.1.23 在60℃用氮气流吹干去除多余的试剂蒸发至10μL。
注意：此步过长的吹干时间可导致丢失分析物。
D.7.1.24 将残留物重新溶于100／μL环己烷-正己烷（6+4）中，旋涡混合5s。
D.7.1.25 注入适量微升体积的衍生物到气相色谱仪作定量测定。
D.7.2 测定条件
D.7.2.1 色谱柱：DB-1，30m×0.254mmi.d.。
D.7.2.2 载气：氦气，线性速度29cm／s。
D.7.2.3 初始柱温：80℃，维持1 min。
D.7.2.4 温度程序：设定30℃／min升至260℃，维持10min或直到对位异构体和氯霉素已经流出。后设定30℃／min升至300℃，维持5rain以确保所有的样品已经流出。
D.7.2.5 进样室温度：280℃。
D.7.2.6 检测器温度：350℃。
D.7.2.7 预期保留时间：氯霉素10min～11 min，异氯霉素9.5min～10.5min。
D.7.2.8 预期响应值：对0.2ng氯霉素可以达到50％全刻度。
D.7.2.9 进样量：适量。
D.7.3 样品测定
分别注入适量标准工作溶液及适当浓度的样品溶液于气相色谱仪中，按上述色谱条件进行色谱分析。响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
D.7.4 计算
用色谱数据处理机或按式（D.1）计算试样中氯霉素残留量：
W= ???????????????????????????????????????????????? （D.1）
式中：
W ??试样中氯霉素残留量，单位为微克每克（μg／g），
H ??试样液中氯霉素的峰高，单位为毫米（mm）；
Hs ??标准工作液中氯霉素的峰高，单位为毫米（mm）；
cs ??标准工作液中氯霉素的浓度，单位为微克每毫升（μg／mL），
c ??最终试样液所代表的试样的浓度，单位为克每毫升（g／mL）。
注：计算结果需扣除空白值。
附 录 E
（规范性附录）
磺胺类药物在动物可食性组织中
残留的高效液相色谱检测方法
E.1 适用范围
本方法用于测定动物可食性组织中磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺二甲基嘧啶（SM?2）、磺胺甲恶唑（SMZ），磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺喹恶啉（SQ）单个或混合物的残留量。
E.2 原理
组织经乙腈提取后，其上清液再加入正己烷，向离心后的下层溶液加入正丙醇，减压干燥后的残留物用乙腈溶解，过Sep-Pak氧化铝B柱，洗脱液再用正丙醇处理，减压干燥后的残留物经流动相溶解后，所制样液用高效液相色谱仪进行检测。
E.3 可靠的检测限
本方法在动物可食性组织中的检测限为0.05μg／g。
E.4 仪器
E.4.1 高效液相色谱仪，配紫外检测器。
E.4.2 匀浆机。
E.4.3 旋转蒸发仪。
E.4.4 磁力搅拌器。
E.4.5 电子天平：感量0.000 01g。
E.4.6 离心机。
E.4.7 振荡器。
E.4.8 抽滤器。
E.4.9 离心管。
E.5 药品和试剂
E.5.1 SMM，SM2，SMZ，SDM，SQ标准品：纯度≥99％。
E.5.2 乙腈：色谱纯。
E.5.3 甲醇：分析纯，经重蒸馏。
E.5.4 乙酸：分析纯。
E.5.5 正己烷：分析纯，经重蒸馏。
E.5.6 正丙醇：分析纯，经重蒸馏。
E.5.7 无水硫酸钠：分析纯。
E.6 溶液
磺胺类药物标准液：准确称取适量各个磺胺药，用甲醇溶解，配制成适当浓度的标准储备液。临用前，取此储备液，用流动相稀释成浓度为0.1μg／mL～20μg／mL的标准工作液。
E.7 分析
E.7.1 Sep-Pak氧化铝B柱的制备
称取高温下加热3h的氧化铝粉，加水搅拌均匀，振荡3h后填充入玻璃柱中，用95％乙腈5mL前处理后备用。
E.7.2 提取和纯化
称取组织样品5g（精确到0.1 g），加人乙腈25mL，无水硫酸钠少许（血清除外），匀浆后，以3 000r／min的速度离心5min。分离后的残渣再用25mL乙腈处理，振荡10min后，以3 000r／min的速度离心5min。合并两次的上清液，加入正己烷30mL，振荡10min后，以3 000r／min的速度离心5min，取下层液体，加入正丙醇10mL，50℃：下减压干燥，残留物用95％乙腈3mL溶解，过Sep-Pak氧化铝B柱。用95％乙腈5mL过柱，不收集，再用70％乙腈10mL洗脱后，洗脱液中加入5mL正丙醇，50℃下减压干燥后，残留物用2.0mL流动相溶解，所制样液用高效液相色谱仪进行检测。
E.7.3 检测条件
E.7.3.1 色谱柱：C18?柱，250mm×4.6mmi.d.。
E.7.3.2 流动相：乙腈-甲醇-水-乙酸（2+2+9+0.2）。
E.7.3.3 流动相流速：1.0mL／min。
E.7.3.4 检测波长：270nm。
E.7.3.5 进样量：20／μL。
E.7.4 样品测定
分别将等体积标准液和试样溶液注入液相色谱仪，标准工作液及试样中磺胺类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。试样液测定过程中要参插注入标准工作液，以便准确定量。
E.7.5 计算
用色谱数据处理机或按式（E.1）计算试样中磺胺类药物残留量：
