无公害食品 猪肉
C.7.1.2 加20mL MCI-Vaine-Na?2EDTA液，盖上帽，漩涡半分钟，手摇5min。
C.7.1.3 以4 500 r／min的速度离心10 min，上清液倒入另一离心管，再加20 mL MCI-Vaine-Na2EDTA液于沉淀中，漩涡半分钟，手摇5min。
C.7.1.4 以4 500 r／min的速度离心5 min，上清液倒入上个试管中，再加10 mL MCI-Vaine-Na?2EDTA液于沉淀中，漩涡半分钟，手摇5min。
C.7.1.5 以4 500r／min的速度离心5min，混合全部上清液（共50mL），以4 500r／min的速度离心10 min。
C.7.1.6 用MCI-aine-Na2EDTA液湿润抽滤瓶、布氏漏斗及滤纸，用较小真空（水泵）过滤上清液，2×2mL MCI-Vaine-Na2EDTA液洗离心管并过滤。
C.7.1.7 C18微柱先依次用20mL甲醇，20mL水冲洗，之后将过滤的液体倒入50mL注射器中，用2×2mL MCI-Vaine-Na2EDTA液洗抽滤瓶并放入注射器中。
C.7.1.8 过C18微柱，使TCS药物吸附在C18微柱上。
C.7.1.9 用20mL水冲洗抽滤瓶倒人注射器中，并过滤，水洗C18微柱。
C.7.1.10 用水冲洗完全后，顶空5 min。
C.7.1.11 用6.0mL 0.01 mol／L草酸甲醇液把TCS药物从C18微柱中洗脱于10mL容量瓶中，用水定容至刻度。
C.7.1.12 上述液用滤膜过滤后，供高效液相色谱仪进行检测。
C.7.2 测定条件
C.7.2.1 色谱柱：C18柱。
C.7.2.2 流动相：甲醇-乙腈-0.01 mol／L草酸（1.5+1.5+2.5）。
C.7.2.3 流速：1.5 mL／min。
C.7.2.4 检测波长：350nm。
C.7.2.5 进样量：10mL。
C.7.3 样品测定
分析样品按亡述仪器操作条件供高效液相色谱仪分析。
C.7.4 计算
用色谱数据处理机或按式（C.1）计算试样中土霉素残留量：
W= ???????????????????????????????????????????????? （C.1）
式中：
W ??试样中土霉素残留量，单位为微克每克（μg／g）；
H ??试样液中土霉素的峰高，单位为毫米（mm）；
Hs ??标准工作液中土霉素的峰高，单位为毫米（mm）；
cs ??标准工作液中土霉素的浓度，单位为微克每毫升（μg／mL）；
c ??最终试样液所代表的试样的浓度，单位为克每毫升（g／mL）。
注：计算结果需扣除空白值。
附 录 D
（规范性附录）
氯霉素残留的气相色谱测定法
D.1 适用范围
本方法用于测定肉牛的肌肉组织中氯霉素的残留量。
D.2 原理
组织经β-葡萄糖醛酸酶消化，经乙酸乙酯提取，然后将乙酸乙酯浓缩。加4％氯化钠溶液，剩余的乙酸乙酯用氮气吹干。将盐溶液过C18萃取小柱，用20％甲醇洗涤，用甲醇洗脱。将洗脱液蒸发至干并固化，用配有电子捕获检测器的气相色谱仪测定氯霉素。异氯霉素做内标物定量。
D.3 可靠的检测限
本方法在牛肌肉组织中的检测限为1.0ng／g。
D.4 仪器
D.4.1 气相色谱仪，配电子捕获检测器（63Ni）。
D.4.2 电子天平；感量0.000 01g。
D.4.3 匀浆机。
D.4.4 离心机。
D.4.5 旋转蒸发仪。
D.4.6 振荡器。
D.4.7 电热恒温水浴锅。
D.4.8 固相萃取柱：C18柱。
D.5 药品与试剂
D.5.1 氯霉素标准品：纯度≥99％。
D.5.2 异氯霉素标准品：内标物。
D.5.3 β-葡萄糖醛酸酶-Ⅸ：生化试剂。
D.5.4 甲醇：色谱纯。
D.5.5 乙酸乙酯：分析纯。
D.5.6 正己烷：分析纯。
D.5.7 三氯甲烷：分析纯。
D.5.8 乙腈：色谱纯。
D.5.9 环己烷：分析纯。
D.5.10 氯化钠：分析纯。
D.6 溶液
D.6.1 氯霉素标准液：准确称取氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成浓度为500μg／mL的标准储备液，置4℃冰箱中保存。临用前，取此储备液，用甲醇稀释成浓度为100ng／mL的标准工作液。
D.6.2 异氯霉素标准液：准确称取异氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成浓度为500μg／mL的标准储备液，置4℃冰箱中保存。临用前，取此储备液，用甲醇稀释成浓度为100ng／mL的内标液。
D.6.3 0.1mol／L KH2PO4和Na2HPO4的缓冲液（pH6.8±0.1）：用相应的干试剂调节pH为6.8。
D.6.4 β-葡萄糖醛酸-Ⅸ：用缓冲液稀释至4 000单位／mL。
D.6.5 Sylon HTP溶液：六甲基二硅烷（HMDS）3份，氯化三甲基硅烷1份，吡啶9份。
D.7 分析
D.7.1 提取和纯化
D.7.1.1 将组织解冻，称取肌肉组织10g（精确到0.1g），置于50mL玻璃离心管中。向每个样品中加100μL。异氯霉素内标液（100ng／mL）。
D.7.1.2 每个分析样品配制1个空白、3个添加样品。向空白组织中加内标。回收率样品中加工作液，制成0.5mL／L（50μL工作液），1.0mL/L（100μL工作液），2.0mL／L（200μL工作液）的样品。由添加样品得到的数据用于计算。
D.7.1.3 向所有空白、添加对照和样品管中加15mL磷酸盐缓冲液（pH6.8士0.1）和200μL。β-葡萄糖醛酸酶（800单位），在室温条件下混合30s～60s。
D.7.1.4 将所有管置于37℃保温90min。保温后，样品可以放在冰箱中过夜。
D.7.1.5 样品放回室温平衡。向各管加乙酸乙酯15 mL，旋涡混合30s提取氯霉素。
D.7.1.6 2 000r／min的速度离心2min。
D.7.1.7 用一次性滴管吸取乙酸乙酯液（上层）留用并转移到另一干净的50mL离心管中。
D.7.1.8 重复（步骤D.7.1.5～D.7.1.7）提取样品，并合并提取液。
D.7.1. 9 在氮气流下，用温度约60℃的沙浴去除乙酸乙酯使体积约为1 mL。
D.7.1.10 向各管加4％氯化钠溶液4 mL，混合5s～10s。
D.7.1.11 继续蒸发去除乙酸乙酯至乙酸乙酯层干，剩下小量的油性残留物。
D.7.1.12 向4％氯化钠溶液层加正己烷4 mL，混合10s。2 000r／min的速度离心l min，弃掉上层。
D.7.1.13 重复步骤D.7.1.12。
注意：以下步骤D.7.1.14至步骤D.7.1.17必须立即连续做完。切莫让吸附剂变干。
